[연구필요성]
크리스퍼(CRISPR-Cas9) 유전자가위는 원하는 유전자의 DNA 염기서열을 선택적으로 잘라냄으로써 유전자를 교정할 수 있어, 암 및 난치성 유전 질환 치료를 위한 차세대 생명공학기술로 크게 주목받아 왔다.
하지만 자연 그대로의 크리스퍼 유전자가위는 표적으로 하는 DNA와 비슷한 염기서열을 지닌 유사 DNA까지도 자르는 낮은 정확도와 그로 인한 비표적 효과가 그 한계로 지적된다. 특히, 인간의 게놈은 약 30억 개의 DNA 염기로 구성되어 있기에, 그 중에서 표적 염기서열 하나만을 정확히 골라 잘라낼 수 있는 표적 특이성은 크리스퍼 유전자가위를 활용한 유전자 치료 기술 개발에 있어 요구되는 필수 요소이다.
단백질 공학적 접근법을 활용하여 표적 정확도를 향상시킨 크리스퍼 유전자가위 변이체가 여럿 개발되어 왔으나, 기존 단백질 공학 기법의 한계로 인해 개선된 표적 선택성 역시 제한적인 결과를 보여주었다.
[연구성과/기대효과]
본 연구에서는 효소 단백질이 효소 반응을 일으키는 과정 동안 겪는 구조 변화 움직임을 동적으로 제어하는 새로운 전략의 합리적 설계(rational design) 단백질 공학 기법을 개발하였다.
본 연구진은 새롭게 고안한 동적 단백질 공학 기법을 활용하여 새로운 크리스퍼 유전자가위 변이체를 개발하였다. 더 나아가, 본 연구에서 개발한 변이체와 기존의 단백질 공학 기법으로 개발된 변이체와의 조합을 통해, 표적 정확도가 더욱 향상된 Correct-Cas9 크리스퍼 유전자가위를 개발해 내는 데에 성공하였다.
이러한 연구 결과는 비표적 효과로부터 자유로운 크리스퍼 유전자가위 개발을 위한 새로운 발판이 될 것으로 기대하며, 염기교정 및 프라임교정 기술 등 크리스퍼 유전자가위에 기반한 최첨단 유전자 교정 기술의 표적 정확도를 높이는 데에도 활용될 수 있을 것으로 예상한다.
그 뿐만 아니라, 본 연구에서 개발한 새로운 동적 합리적 설계 기법은 크리스퍼 유전자가위 이외에도 다양한 효소 단백질의 특성 개선에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
본 연구는 생화학분야 국제 학술지인 42서울토토사이트 세션교Nucleic Acids Research)에 출판되었다.
42학부토토사이트 세션
크리스퍼(CRISPR-Cas9) 유전자가위는 원하는 유전자의 DNA 염기서열을 선택적으로 잘라냄으로써 유전자를 교정할 수 있어 암 및 난치성 유전 질환 치료를 위한 차세대 생명공학기술로 크게 주목받아 왔다. 하지만 자연 그대로의 크리스퍼 유전자가위는 표적 DNA와 비슷한 염기서열을 지닌 유사 DNA까지도 자르는 낮은 정확도 및 그로 인한 비표적 효과가 한계로 지적된다. 특히, 인간의 게놈은 약 30억 개의 DNA 염기로 구성되어 있기에, 그 중에서 표적 염기서열만을 정확히 골라 잘라낼 수 있는 표적 특이성은 크리스퍼 유전자가위를 활용한 유전자 치료 기술 개발에 있어 요구되는 필수 요소이다. 이에, 지난 10년간 단백질 공학적 접근법을 활용하여 표적 정확도를 향상시킨 크리스퍼 유전자가위 변이체가 여럿 개발되어 왔으나, 개선된 표적 선택성 역시 여전히 제한적인 수준에 머무르고 있다.
서울토토사이트 세션교 의과토토사이트 세션 배상수 교수팀은 토토사이트 화학부 김성근 명예교수(현 포항공과토토사이트 세션교 총장) 및 연세토토사이트 세션교 의과토토사이트 세션 김형범 교수팀과 공동연구를 통해 기존 한계를 극복하기 위한 새로운 전략의 단백질 합리적 설계 기법을 개발4HK사업단공동 제1저자는 토토사이트 성기원 연구교수, 정영리 박사, 김나혜 박사). 기존의 합리적 설계 기반의 접근법들은 단백질(혹은 효소) 분자의 3차원 구조에 대한 정적인‘사진’을 바탕으로 해당 구조를 변형하여 단백질의 기능을 개선하고자 한다. 그에 따라, 기 개발된 크리스퍼 유전자가위 변이체들 역시 DNA와 직접적으로 상호작용하는 것으로 보고된 단백질 영역 및 아미노산 서열들 위주로 돌연변이가 도입되었다. 그러나 효소 및 단백질 분자들은 실제로는 여러 형태의 3차원 구조를 가지며 그들 사이에서의 끊임없는 구조변화를 통해 생화학적 기능을 수행한다. 따라서 본 연구에서는 효소 단백질이 효소 반응을 일으키는 동안 겪는 구조 변화 과정을 ‘동영상’으로 파악한 뒤, 그 실제적인 구조 변화의 동적인 과정을 제어하는 전략을 개발하였다.
이러한 동적 단백질 공학 기법을 바탕으로, 본 연구진은 새로운 크리스퍼 유전자가위 변이체를 개발하였다. 이 새로운 단백질 공학 전략은 기존의 합리적 설계 기반 접근법들에서는 고려하지 못하는 구조 변화를 제어하고자 하기에, 기존의 기법과는 다른 단백질 영역 및 아미노산 서열을 돌연변이의 대상으로 특정하게 된다. 그 결과, 본 연구에서는 기존 단백질 공학 연구에서 다뤄지지 않았던 크리스퍼 유전자가위 효소단백질 내 REC2 영역에 돌연변이를 도입함으로써, 표적 정확도가 향상된 변이체를 새롭게 개발하였다. 나아가, 본 연구진은 새롭게 개발한 REC2 변이체와 기존의 합리적 설계 기법으로 개발된 변이체의 돌연변이를 조합하여 표적 정확도가 더욱 향상된 크리스퍼 유전자가위(Correct-Cas9이라 명명함)를 개발해 내는 데에 성공하였다.
이러한 연구 결과는 비표적 효과로 인한 부작용으로부터 자유로운 크리스퍼 유전자가위 기술을 개발해 나가는 데에 있어 새로운 발판이 될 것으로 기대하며, 염기교정 및 프라임교정 기술 등 크리스퍼 유전자가위에 기반한 최첨단 유전자 교정 기법의 표적 정확도를 높이는 데에도 활용될 수 있을 것으로 예상한다. 그 뿐만 아니라, 본 연구에서 개발한 동적 합리적 설계 전략은 크리스퍼 유전자가위 이외에도 다양한 효소 단백질의 기질 특이성 개선에 활용될 수 있을 것으로 기대한다.
4연구기자재지원
A rational engineering strategy for structural dynamics modulation enables target specificity enhancement of the Cas9 nuclease
Keewon Sung, Youngri Jung, Nahye Kim, Yong-Woo Kim, Hyongbum Henry Kim, Seong Keun Kim, and Sangsu Bae
(Nucleic Acids Research, https://doi.org/10.1093/nar/gkaf535)
[용어설명]
- 44교육크리스퍼 유전자가위는 표적 DNA 염기서열을 인식하기 위한 가이드 RNA와 이를 절단하기 위한 Cas9 핵산절단효소 단백질로 구성되어 있다. 본래는 세균이 천적인 바이러스를 물리치기 위해 지니고 있는 면역 시스템으로 발견되었으나, 인간 세포에서 표적 유전자의 DNA 염기서열을 잘라내는 데에 활용될 수 있다는 것이 입증되며 크리스퍼 유전자가위로 불리게 되었다. 가이드 RNA의 서열만을 바꿔주면 손쉽게 표적 DNA 서열을 변경할 수 있어 유전자 교정 기술로 각광받고 있다.
- 44교육단백질 공학이란 단백질을 구성하는 아미노산 서열에 돌연변이를 도입하여 단백질의 특성을 원하는 방향으로 변화시키는 연구방법론을 뜻한다. 단백질 공학 기법은 크게 합리적 설계법과 방향적 진화법(Directed evolution) 두 가지로 분류할 수 있다. 합리적 설계법은 단백질의 3차원 구조 및 생화학적 지식을 토대로 돌연변이를 논리적으로 설계하는 기법이며, 방향적 진화법은 무작위로 돌연변이를 도입한 뒤 원하는 특성을 띠는 변이체를 걸러내는 방식을 일컫는다.
4예비 토토사이트 세션원생
왼편과 중앙의 모식도는 효소 반응 경로에 따른 효소 단백질(E)의 구조 변화를 도식화한 것으로, 기존 합리적 설계 전략(초록색)과 본 연구에서 새로 개발한 동적 합리적 설계 전략(파란색)의 작동원리 차이를 보여준다(검정색 곡선이 자연 그대로의 야생형 효소에 해당함). 본 연구에서는 동적 합리적 설계 전략을 활용하여 크리스퍼 유전자가위의 REC2 영역을 새롭게 변형하였고, 이를 기존의 합리적 설계법으로 개발된 변이체와 조합함으로써 표적 정확도가 크게 향상된 유전자가위(Correct-Cas9)를 개발하였다.