초고해상도 근접분자 표지 화학기술로 미토콘드리아 미세 공간 내 단백질체 정밀 분석 실현
[연구필요성]
단백질은 세포 내에서 무작위로 배치하는 것이 아닌 지정된 위치에서 고유한 기능을 수행하기 때문에, 단백질의 정확한 위치를 규명하는 것은 분자적 메커니즘을 밝혀내는데 매우 중요하다. 인간 세포의 미토콘드리아에도 약 1,400개의 단백질이 존재하는 것이 밝혀졌으나, 내부 미세 공간에 대한 위치 정보는 아직 부족하다. 이중 막으로 이루어진 미토콘드리아의 막 사이 공간은 구조 및 기능적으로 구분되는 공간으로 나뉠 수 있다. 하나는 내막이 안쪽으로 주름진 형태의 크리스타로 둘러싸인 크리스타 내강 (intracristal space)이고, 다른 하나는 세포질에 인접한 외막과 내막 사이의 주변부 공간 (peripheral space)이다. 하지만 두 공간은 막으로 분리되어 있지 않아, 기존의 기술로는 구분하여 분리할 수 없으므로 새로운 기술 개발이 필요하다.
[연구성과/기대효과]
본 연구에서는 중탄소 (heavy carbon)을 이용해 새롭게 합성한 중탄소 디싸이오바이오틴-페놀 (HDBP)와 기존의 DBP를 이용하여 미세 공간의 단백질체를 분석할 수 있는 기술 (ICAX)를 개발하였다. 이를 이용하여 물리적인 방법으로 분리를 할 수 없는 미토콘드리아 크리스타 내강과 주변부 공간의 단백질체를 각각 규명하였다. 해당 기술은 미토콘드리아를 포함한 세포 내 다양한 공간에서 활용할 수 있으며, 정상 모델과 생리학적 질병 모델의 단백질체를 비교하는 연구에 매우 유용하게 사용할 수 있다. 또한, ICAX 기술의 원리는 다른 근접분자 표지 화학기술에서도 마찬가지로 적용되어 다양한 연구에 활용될 것으로 내다본다.
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토토사이트 화학부 이현우 교수 연구팀, 생명과학부 김종서 교수 연구팀, 그리고 울산과학기술원 화학과 기정민 교수 연구팀으로 이뤄진 공동연구팀이 정량 분석이 가능한 초고해상도 근접분자 표지 화학 (super-resolution proximity labeling) 기술을 개발하였다. 이 기술을 사용하여 세포 안에 있는 서로 다른 두 미세 공간 사이에 존재하는 단백질들의 상대적 위치를 추정할 수 있으며, 이를 이용해 미토콘드리아의 미세 구조인 크리스타 내강 단백질체를 규명하였다.
크리스타 내강은 주변부 공간과 물리적으로 분리할 수 없으므로 살아 있는 세포 내에서 크리스타 내강에 국한된 단백질체에만 선택적으로 표지할 수 있는 근접분자 표지 화학기술이 필요하다. 특히, 크리스타 내강과 주변부 공간은 굉장히 근접해 있으므로, 본 공동연구팀은 기존의 근접분자 표지 화학과 비방사성 동위 원소 표지법의 원리를 응용하여 서로 다른 위치에 있는 표지 효소 사이의 공간에 존재하는 단백질들의 상대적 거리를 추정할 수 있는 정량적 기술인 ICAX를 개발하였다. ICAX 기술에서는 APEX의 프로브인 데스싸이오바이오틴 페놀 (desthiobiotin-phenol, DBP)과 중탄소로 치환된 DBP (HDBP)를 이용하여 각각 다른 공간에 발현된 APEX에 의해 주변 단백질을 표지시키게 된다. 이때 두 공간 사이의 단백질을 질량 분석으로 검출하였을 때 DBP와 HDBP로 표지된 세기의 비율에 따라 상대적 거리를 예측할 수 있다.
이 기술을 이용하여 산화적 인산화 복합체 (OXPHOS complex), 단백질 분해효소 (protease), 그리고 칼슘 이온을 운반하는 MCU 복합체의 단위체들을 포함한 64개의 단백질이 크리스타 내강에 위치하는 것을 발견하였다. 반면 여러 대사물질을 운반하는 단백질이나 전환하는 효소들을 포함한 58개의 단백질이 주변부 공간에서 주로 발견되었다. 추가적으로 이 기술을 이용하여 크리스타 구조를 조절하는 MICOS 단위체인 MIC60 단백질의 발현양을 줄이거나 미토콘드리아 짝풀림제를 이용하여 막 전위를 없애 ATP 생성을 막았을 때 크리스타 내강 단백질체의 구성이 변하고 이로 인해 미토콘드리아 막 투과성이 증가하는 것을 밝혀냈다. 이러한 결과는 미토콘드리아의 구조 및 기능에 이상이 생겼을 때 일어나는 분자적 메커니즘의 이해를 넓힐 수 있을 것으로 내다본다.
본 연구에서 기존의 근접분자 표지 화학 기술의 응용범위를 넓혀 특정 두 공간 사이의 단백질체 분포를 밝혀낼 수 있는 새 기술을 개발하였으며, 영국 저명 학술지‘Nature Communications (Impact factor: 15.7)’에 게재되었다.
이번 연구는 한국연구재단, 4단계 두뇌한국21 사업, 보건복지부, 정보통신기술부, 기초과학연구원(ibs) 그리고 삼성미래기술육성 사업의 지원을 받아 수행되었다.
[연구결과]
Intracristal space proteome mapping using super-resolution proximity labeling with isotope-coded probes
Myeong-Gyun Kang, Sanghee Shin, Dong-Gi Jang, Ohyeon Kwon, Song-Yi Lee, Pratyush Kumar Mishra, Minkyo Jung, Ji Young Mun, Jung-Min Kee, Jong-Seo Kim & Hyun-Woo Rhee
(Nature Communications, https://www.nature.com/articles/s41467-025-62756-0)
미토콘드리아 막 사이 공간은 구조 및 기능적으로 크리스타 내강과 주변부 공간으로 구분되지만, 기술적 한계로 인해 해당 공간들의 구성 성분은 전혀 알려지지 않았다. 이를 밝혀내기 위해 본 연구에서는 정량적 분석이 가능한 초고해상도 근접분자 표지 화학 기술 (Super-resolution proximity labeling)을 개발하여 크리스타 내강 단백질과 주변부 공간 단백질을 규명하였다.
[용어설명]
- 44단계 두뇌한국(BK)21사업이는 효소나 광촉매를 세포 내 특정 위치에 표적시켜 주변의 생체 분자 (단백질, RNA, 그리고 지질 등)에 바이오틴과 같은 특정 화학 물질을 전달하여 표지를 시키는 기술을 말한다. 표지된 생체 분자는 일반 생체 분자들과 구분되어 분석할 수 있으므로, 이 기술은 살아 있는 세포 내에서 위치 정보를 표시할 수 있다. 효소로는 과산화효소 기반의 APEX와 바이오틴 라이게이즈 기반의 TurboID가 사용되고, 광촉매로는 이리듐 복합체가 널리 사용된다. 이번 연구에서 사용된 DBP는 APEX를 통해 다른 생체 분자와 공유 결합을 이룰 수 있다.
- 44단계 두뇌한국(BK)21사업대부분 기존 연구에서 근접분자 표지 화학기술을 사용한 질량 분석 시 바이오틴으로 표지된 단백질을 면역침전법으로 분리하여 트립신 분해 후 펩타이드 분석을 진행하는데, 이 방법은 분리된 단백질에서 바이오틴으로 표지되지 않은 펩타이드 부위를 분석하는 것으로 false positive 결과를 도출할 수 있다. 이번 연구에서 사용된 초고해상도 근접분자 표지 화학기술은 먼저 트립신 분해 후 바이오틴으로 표지된 펩타이드를 면역침전법으로 분리하여 표지된 펩타이드만 분석하는 방법으로 훨씬 정교한 방법이라고 할 수 있다.
- 44단계 두뇌한국(BK)21사업미토콘드리아 막 사이 공간의 세부 구조 중 하나이며, 주름진 형태의 크리스타로 둘러싸인 크리스타 내강은 주변부 공간과는 달리 외막과 상대적으로 멀리 위치한다. 이러한 구조적 특성은 미토콘드리아가 산화적 인산화를 통해 ATP를 생성하는 과정에서 양성자를 크리스타 내강 안에 축적함으로써, 양성자의 확산을 제한하고 전기화학적 기울기를 유지하는데 기여하는 것으로 보인다.
- 44단계 두뇌한국(BK)21사업인간 세포의 경우 MICOS 복합체는 MIC60을 포함한 7개의 미토콘드리아 단백질로 이루어져 있으며, 내막에 위치하고 있다. 크리스타 구조를 유지하고 형성하는데 핵심적인 역할을 하며 외막에 있는 복합체들과 소통을 하며 내막과 외막 사이의 물질 교환 조절에도 중요한 역할을 한다.
- 44단계 두뇌한국(BK)21사업미토콘드리아 짝풀림 현상을 일으키는 물질로 ATP 생성 없이 양성자를 막 사이 공간에서 기질로 운반하여 양성자 농도 구배를 감소시킨다. 대표적으로 Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)나 BAM15가 널리 쓰이고 있다.
[그림설명]
(a) APEX2의 단백질 표지 메커니즘을 나타낸 모식도. (b) ICAX 기술에서 서로 다른 공간에 위치하는 APEX2 사이의 단백질들의 상대적 거리를 계산하는 방법의 모식도.