Continuous Targeted Hypermutation with a Tunable Mutation Window
[연구필요성]
유도진화는 효소 및 단백질과 같은 생체분자를 실험실 내에서 진화시키고자 하는 분자생물학적 기술로 신약 및 효소 개발에 널리 이용되고 있다. 효율적인 유도진화를 위해서 DNA 내 돌연변이를 만들어 내는 다양한 기술들이 개발되어 왔지만, 우리 몸 속 항체 성숙과정에서 보여지는 위치특이적 돌연변이 도입방법은 알려지지 않았다.
[연구성과/기대효과]
본 연구에서는 항체 친화도 성숙 과정에서의 DNA 다양화를 모사한 새로운 표적 DNA 돌연변이 방법을 개발하였다. 이 방법이 기존 방법들과 구별되는 가장 큰 독창성은 크리스퍼-카스(CRISPR-Cas) 시스템 중 한 종류인 Cascade 시스템의 특징을 활용하여, 돌연변이 표적범위를 ~200개 염기서열 내에서 원하는 대로 조절할 수 있다는 점에 있다. 또한 여러개의 표적 DNA에 동시에 돌연변이를 만들어 낼 수 있고, 다수의 돌연변이를 연속적으로 도입할 수 있다는 장점이 있으며, 실제로 효소진화에 쓰일 수 있음을 보여주었다. 이 기술은 항체기반 신약개발, 친환경적 효소개발 등 단백질 공학 및 합성생물학 분야의 핵심기술로 이용될 수 있다.
[본문]
개요
토토사이트 화학부 김석희 교수 및 이찬우 박사과정 학생은 항체 다양화 과정을 모사한 독창적인 표적 DNA 돌연변이 방법을 개발하였다고 보고하였다.
이 연구는 Nature Communications(피인용지수 15.7)에 ‘Continuous Targeted Hypermutation with a Tunable Mutation Window’라는 제목으로 게재되었다. (https://doi.org/10.1038/s41467-025-66736-2; 제1저자, 토토사이트 이찬우 박사과정생; 교신저자, 서울올림피아토토교 김석희 교수)
4전문올림피아토토원
생명체는 다양한 환경에 적응하기 위해 매우 다양한 생체분자를 끊임없이 만들어내어 진화시키고 있다. 예를들어 항체는 외부 감염에 저항하기 위해 우리 몸 안에서 진화한 단백질이라고 할 수 있다.
생체분자의 진화는 DNA 수준에서 다양한 돌연변이를 만들고, 유용한 기능을 가지는 변이체를 선택하는 과정으로 이루어진다. 이 과정을 실험실에서 모방하는 유도진화는 항체신약 및 친환경적 효소 개발 등에 큰 파급효과를 가져왔지만, 자연계의 생체분자 진화과정을 조금이라도 따라잡기 위해서는 더 혁신적인 방법들을 필요로 한다.
최근 ~8년동안 DNA 돌연변이를 세포 내에서 도입하는 방법들이 크게 각광받으면서, 세포 내 다양한 DNA 부위에 돌연변이를 도입하는 매우 독창적인 방법들이 발표되어왔다. 하지만 항체의 친화도 성숙 과정에서 보여지는 방식인, 유전자 내 일부 핵심적인 부위만을 표적으로 하는 방법은 알려진 바 없다.
[연구결과]
Continuous targeted hypermutation with a tunable mutation window
Chanwoo Lee & Seokhee Kim
(Nature Communications https://doi.org/10.1038/s41467-025-66736-2)
본 연구에서는 항체 친화도 성숙 과정에서의 DNA 다양화를 모사한 독창적인 표적 DNA 돌연변이 방법을 개발하였다.
이 방법의 독창성은 CRISPR-Cas 시스템 중 한 종류인 Cascade 시스템의 특징을 적극 활용하여 ~200개 염기서열 내에서 표적범위의 유연성을 확보하였다는 점이다. 기존 많이 쓰이는 Cas9 기반 CRISPR-Cas 시스템이 고정된 숫자(20개) 염기서열을 인식하는데 반해, Cascade는 표적 DNA를 인식하는 crRNA의 스페이서 길이에 따라 인식하는 염기서열 길이가 정해진다. 이를 활용하면 표적의 시작점만 지정할 수 있는 기존 방법과는 달리 표적의 시작점 및 끝나는 점도 정확하게 조절이 가능하고, 따라서 돌연변이 표적범위를 ~200개 염기서열 내에서 원하는 대로 조절할 수 있었다.
또한 여러개의 crRNA를 동시에 이용하여, 여러개의 표적 DNA에 동시에 돌연변이를 만들어 낼 수 있었고, 시간을 두고 다수의 돌연변이를 순차적으로 도입할 수 있었으며, 이를 효소진화에 이용할 수 있음을 보여주었다.
이 기술은 항체기반 신약개발, 친환경적 효소개발 등 유도진화가 응용될 수 있는 단백질 공학 및 합성생물학 분야의 핵심기술로 이용될 수 있다. 예를 들어 항체 유전자 내 항원과의 결합부위(complementarity-determining region, CDR)만 변이시키는 방식으로 항체공학에 응용성이 높을 수 있다. 또한 하나의 단백질 내 여러 도메인 중 하나만 변이시키거나 특정 분자와의 상호작용에 관여하는 부분만 변이시키는 것도 가능할 것이다.
□ 용어설명
CRISPR-Cas: 유전자 가위로 잘 알려진 크리스퍼 카스로, 흔히 알려진 type2에 속하는 Cas9외에도 다양한 type이 존재한다. 해당 논문에서 사용된 크리스퍼 카스는 type1에 속하며, 다양한 단백질의 복합체로써 기능한다는 점이 특기할만한 점이다.
crRNA: 크리스퍼 카스와 결합하는 RNA를 일컫는 말. crRNA의 서열에 상보적인 가닥의 DNA가 크리스퍼 카스-RNA 복합체와 결합하게 된다. crRNA의 서열을 바꾸는 것만으로 지정하고 싶은 DNA를 마음대로 조정할 수 있다.
스페이서: crRNA가 결합하는 DNA 부분
□ 그림설명
연속적 유도 진화를 위한 부위 특이적 돌연변이 촉진 도구